Calcein AM

 

Nama Produk	Kucing.Tidak.	Spesifikasi..
Calcein AM	G1728-0.1ML	0.1 mL

 

 

Calcein AM (Calcein acetoxymethyl ester), berasaskan Calcein dengan pengenalan kumpulan acetoxymethyl ester (AM), yang meningkatkan hidrofobisiti, jadi ia boleh dengan mudah menembusi membran sel hidup. Calcein AM sendiri ialah sebatian telap sel, bukan pendarfluor dan hidrofobik yang, apabila masuk ke dalam sel, dihidrolisiskan oleh esterase endogen dalam sel untuk menghasilkan molekul kutub bercas negatif yang kuat Calcein yang tidak dapat meresap membran sel, dan dengan itu adalah dikekalkan dalam sel, manakala Calcein (panjang gelombang pengujaan maksimum: 494 nm; panjang gelombang pelepasan maksimum: 517 nm) boleh mengeluarkan pendarfluor hijau yang kuat. Berbanding probe lain yang serupa (cth BCECF AM dan CFDA AM), Calcein AM kini merupakan salah satu probe pendarfluor yang paling ideal untuk mengotorkan sel hidup kerana sitotoksisitinya yang sangat rendah, hampir tiada kesan ke atas fungsi selular seperti percambahan sel atau kemotaksis limfosit, dan sensitiviti pH rendah.

Disebabkan kekurangan esterase dalam sel mati, Calcein AM hanya digunakan untuk ujian daya maju dan pelabelan jangka pendek sel hidup. Pewarna asid nukleik pendarfluor merah Propidium Iodide (PI) tidak menembusi membran sel sel hidup, ia melalui kawasan bercelaru membran sel mati ke nukleus dan membenamkan dirinya dalam heliks berganda DNA sel untuk menghasilkan pendarfluor merah ( pengujaan: 535 nm, pelepasan: 617 nm), oleh itu PI hanya mengotorkan sel mati. Calcein AM sering digunakan dalam kombinasi dengan propidium iodide (PI) untuk pewarnaan dwi pendarfluor serentak bagi sel hidup dan mati. Oleh kerana kedua-dua Calcein dan PI-DNA boleh teruja pada 490 nm, sel hidup dan mati boleh diperhatikan secara serentak oleh mikroskop pendarfluor. Dengan pengujaan 545 nm, hanya sel mati yang boleh diperhatikan.

Calcein AM boleh digunakan dalam kebanyakan sel mamalia. Telah ditunjukkan bahawa Calcein AM boleh digunakan dalam beberapa sel tumbuhan seperti sel seperti margin akar Arabidopsis dan beberapa yis seperti Pichia anomala dan Saccharomyces cerevisiae. Parasit tertentu seperti Leishmania tidak boleh memasuki sel hidup kerana komponen membran sel, tetapi Calcein AM boleh memasuki sel parasit pada peringkat awal apoptosis, dan dengan itu digunakan bersama-sama dengan PI untuk pengesanan parasit pada peringkat awal apoptosis. Calcein AM tidak sesuai digunakan pada kulat dan bakteria kerana ia mempunyai dinding sel yang menghalang Calcein AM daripada memasuki sel.

Calcein sendiri ialah penunjuk kompleksasi logam, dan isyarat pendarfluor dipadamkan apabila ia kompleks dengan ion logam seperti Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Fe³⁺, dan Mn²⁺pada pH fisiologi, menjadikan Calcein AM juga merupakan probe pendarfluor hijau yang boleh digunakan untuk menentukan liang peralihan kebolehtelapan mitokondria.

Produk ini, Calcein AM, mempunyai ketulenan tinggi dan terlarut dalam DMSO kontang pada kepekatan 2 mM. Kepekatan akhir Calcein AM yang biasa digunakan ialah 0.1-5.0 μM. Untuk mendapatkan hasil yang lebih diingini, sila laraskan kepekatan akhir Calcein dengan sewajarnya mengikut jenis sel dan situasi sebenar eksperimen.

 

 

-20 ijazah untuk penyimpanan dan pengangkutan, sah selama 12 bulan.

 

 

Komponen	G1728-0.1ML
Calcein AM	0.1 mL
Manual	1 pc

 

 

Penyelesaian kerja pewarnaan Calcein AM telah disediakan:

Cairkan produk dengan penimbal yang sesuai, seperti medium kultur bebas serum, HBSS (G4203) atau PBS (G4202), untuk menyediakan penyelesaian kerja pewarnaan Calcein AM pada kepekatan daripada 0.1-5.0 µM.

Nota: Kepekatan akhir Calcein AM disyorkan untuk dilaraskan dengan sewajarnya mengikut jenis sel dan realiti eksperimen.

 

Prosedur

1. Ujian mikroskop pendarfluor atau ujian zimografi pendarfluor untuk sel penggantungan:

a) Sel dikira selepas rawatan tertentu mengikut reka bentuk eksperimen. Ambil sel yang sesuai dan sentrifuge pada 250×g selama 5 minit pada suhu bilik, buang supernatan, dan tambahkan jumlah penyelesaian kerja pewarnaan Calcein AM yang sesuai untuk menjadikan ketumpatan sel kira-kira 1×10⁶/ml.

b) Inkubasi sel pada suhu 37ºC selama 30-45 min, masa pengeraman optimum adalah berbeza untuk sel yang berbeza. Pertimbangkan 30 minit sebagai masa inkubasi awal, dan optimumkannya mengikut situasi percubaan khusus untuk mendapatkan hasil pengesanan yang lebih ideal.

c) Pada penghujung pengeraman, sentrifuge pada 250×g selama 5 minit, sedut supernatan, dan perlahan-lahan menggantung semula sel dengan menambah medium kultur pra-panas 37ºC.

d) Ulangi langkah c dua kali atau lebih untuk mencuci secukupnya untuk menghilangkan sisa larutan pewarna.

e) Gantikan medium kultur pra-panas segar 37ºC dan eramkan pada 37ºC selama 30 minit lagi dari cahaya untuk memastikan esterase intraselular menghidrolisis Calcein AM secukupnya untuk menghasilkan Calcein dengan pendarfluor hijau.

f) Sel-sel telah disentrifugasi pada 250 × g selama 5 minit pada suhu bilik, kebanyakan medium kultur disedut, dan sel-sel digantung semula dengan medium kultur yang tinggal dan disapu, dan kemudian diperhatikan di bawah mikroskop pendarfluor atau dikesan oleh pendarfluor. zymography.Panjang gelombang pengujaan maksimum Calcein ialah 494 nm, dan panjang gelombang pancaran maksimum ialah 514 nm.Jika perlu, pewarnaan semula pendarfluor lain boleh dijalankan, dan keseluruhan proses harus dielakkan dengan operasi ringan.

 

2. Ujian mikroskop pendarfluor sel melekat atau ujian pelabelan enzim pendarfluor:

a) Sel telah diinokulasi pada piring petri, plat kultur sel multiwell atau perangkak sel dan dirawat dengan cara tertentu mengikut reka bentuk eksperimen.

b) Sedut larutan kultur dan basuh sel 1-2 kali dengan PBS.

c) Tambah jumlah yang sesuai Larutan Pewarnaan Calcein AM dan goncang perlahan-lahan supaya pewarna meliputi semua sel secara sekata. Secara amnya, isipadu 96-plat telaga ialah 100 ul setiap telaga, 24-plat telaga ialah 250 ul setiap telaga, 12-plat telaga ialah 500 ul setiap telaga, dan 6- plat telaga ialah 1 ml setiap telaga.

d) Inkubasi pada 37ºC selama 30-45 min, masa pengeraman optimum berbeza-beza untuk sel yang berbeza. Ambil 30 minit sebagai masa pengeraman awal, dan optimumkan masa pengeraman mengikut sel yang digunakan untuk mendapatkan kesan pewarnaan yang lebih ideal.

e) Pada akhir pengeraman, medium kultur digantikan dengan medium kultur pra-panas segar pada 37ºC dan diinkubasi pada 37ºC selama 30 minit lagi dari cahaya untuk memastikan esterase intraselular menghidrolisiskan Calcein AM dengan secukupnya untuk menghasilkan Calcein dengan pendarfluor hijau. .

f) Sedut cecair kultur, basuh dengan PBS selama 2-3 kali, dan kemudian tambah cecair kultur sel bebas serum boleh diperhatikan di bawah mikroskop pendarfluor atau dikesan oleh penanda enzim pendarfluor. Calcein mempunyai panjang gelombang pengujaan maksimum 494 nm dan panjang gelombang pancaran maksimum 514 nm, dan boleh diwarnakan lagi dengan pendarfluor lain jika dikehendaki, menjauhkan keseluruhan proses daripada cahaya.

 

3. Ujian sitometri aliran:

a) Selepas penghadaman trypsin sel-sel yang melekat, tangguhkan semula sel dalam medium kultur, gantung sel untuk kegunaan terus, kira, sentrifuge jumlah sel yang sesuai pada 250×g selama 5 minit pada suhu bilik, buang supernatan, dan tambahkan yang sesuai. isipadu larutan kerja pewarnaan Calcein AM supaya sel adalah penggantungan sel tunggal dan ketumpatan sel adalah lebih kurang 1×106 /ml, dengan isipadu 1 ml untuk setiap sampel. NOTA: Adalah perlu untuk menyediakan sampel sel penimbal sahaja untuk digunakan sebagai kawalan negatif dalam ujian sitometri aliran. kawalan negatif untuk ujian sitometri aliran, dan adalah wajar untuk memastikan penimbal ini sama seperti penimbal yang digunakan untuk menyediakan Penyelesaian Kerja Pewarnaan Calcein AM.

b) Inkubasi selama 30 minit pada 37ºC dari cahaya.

c) Selepas pengeraman selesai, sel-sel dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 250 × g selama 5 minit pada suhu bilik. Tambah 1 ml penimbal bagi setiap sampel, tangguh semula perlahan-lahan, dan kumpulkan sel dengan sentrifugasi pada 250×g selama 5 minit pada suhu bilik. Nota: Langkah ini membuang lebihan pewarna dan reagen yang boleh menyebabkan pelindapkejutan pendarfluor.

d) Tangguhkan semula sel dengan penimbal 400 µl. Pewarnaan selanjutnya juga boleh dilakukan jika perlu. Ambil perhatian bahawa keseluruhan proses harus dilakukan jauh dari cahaya. Selepas pewarnaan, sampel diletakkan di atas ais dan boleh dikesan secara sitometrik dan dianalisis dalam masa 1 jam.

e) Ambil perhatian bahawa sampel sel penimbal sahaja dan tidak ternoda telah digunakan untuk tetapan kawalan negatif sitometer aliran. Calcein mempunyai panjang gelombang pengujaan maksimum 494 nm dan panjang gelombang pancaran maksimum 514 nm.

 

 

1. Semua pewarna pendarfluor mempunyai masalah pelindapkejutan, dan penjagaan mesti diambil untuk mengelakkan cahaya sebanyak mungkin untuk memperlahankan pelindapkejutan pendarfluor.

2. Calcein AM sangat sensitif kepada kelembapan dan cenderung untuk terurai dalam persekitaran lembap, oleh itu larutan Calcein AM mesti dimeterai rapat dengan penutup selepas setiap pengeluaran. Adalah disyorkan untuk menyimpan dalam bungkusan tertutup yang berasingan mengikut dos tunggal. Jangan gunakan petua pipet yang mengandungi air.

3. Memandangkan Calcein AM tidak stabil dalam larutan akueus seperti PBS, penyelesaian kerja pewarnaan mesti disediakan dan digunakan sekarang.

4. Serum dan fenol merah dalam medium kultur mempunyai kesan ke atas pewarnaan Calcein AM, dan adalah disyorkan agar sel dibasuh secukupnya sebelum menambahkan larutan kerja Calcein AM.

5. Sel berlabel Calcein AM dengan pendarfluor seragam adalah pilihan yang baik untuk pengesanan sel dan pewarnaan sitoplasma umum, walau bagaimanapun, ia tidak mengikat apa-apa dan mungkin ditarik balik secara aktif daripada sel dalam masa beberapa jam, dan pengekalan calcein dalam sel hidup bergantung kepada ciri-ciri yang wujud bagi jenis sel dan keadaan kultur.

6. Pewarnaan Calcein AM tidak boleh diikuti dengan penetapan aldehid atau Calcein akan hilang semasa penetapan. Di samping itu, sebarang gangguan pada membran plasma (cth, agen penyahkerak atau rawatan trypsin) akan mengakibatkan kebocoran pewarna daripada sel.

7. Jika Calcein AM mengalami kesukaran memasuki sel, surfaktan seperti Pluronic F127 boleh digunakan. Larutan Calcein AM pada kepekatan 1/10 juga boleh digunakan sebagai ganti medium kultur.

8. Produk ini terhad kepada penggunaan penyelidikan saintifik oleh profesional, dan tidak boleh digunakan untuk prosedur atau rawatan diagnostik, makanan atau ubat, atau disimpan di kediaman biasa.

9. Untuk keselamatan dan kesihatan anda, sila pakai kot makmal dan sarung tangan pakai buang.

 

Untuk Kegunaan Kajian Sahaja!

 

 

Cool tags: calcein am, China calcein am pengilang, pembekal, kilang