2×In-Fusion Cloning Mix Plus

 

Nama Produk	Kucing. Tidak.	Spesifikasi
2×In-Fusion Cloning Mix Plus	G3351-20T	20 T
	G3351-100T	100 T

 

2×In-Fusion Cloning Mix Plus menawarkan peningkatan kecekapan pengklonan berbanding generasi sebelumnya bagi kit In-Fusion (G3350,2×In-Fusion Cloning Mix), terutamanya untuk berbilang serpihan. Ia direka untuk pengklonan pantas satu atau 2~5 berbilang serpihan DNA ke dalam mana-mana vektor. Ia menggabungkan serpihan DNA (cth, sisipan yang dijana PCR dan vektor linear) dengan cekap dan tepat dengan mengenali 15-25 pertindihan bp di hujungnya. Pertindihan 15-25 bp ini boleh direka bentuk dengan mereka bentuk primer untuk penguatan jujukan yang diingini. Sisipan serentak berbilang serpihan sangat memudahkan langkah percubaan, meningkatkan kecekapan pengklonan dan menjimatkan masa anda.

 

1. Reka bentuk primer serpihan tunggal: 15-25 jujukan bp yang konsisten dengan kedua-dua hujung vektor linear telah dimasukkan ke dalam hujung 5' primer penguatan sisipan. Reka gambar rajah di bawah:

2. Reka bentuk primer berbilang serpihan: Prinsip reka bentuk primer pada kedua-dua hujung vektor adalah sama seperti prinsip primer serpihan tunggal. Tetapkan semula zon antara prinsip reka bentuk primer serpihan adalah seperti berikut: Terdapat pertindihan 15-25 bp antara primer terbalik Fragment 1 dan primer hadapan Fragment 2. Primer terbalik untuk Fragment 1 termasuk kawasan bertindih dan spesifik terbalik rantau primer, primer hadapan untuk Fragmen 2 termasuk kawasan bertindih dan rantau primer khusus ke hadapan, dan seterusnya (kawasan bertindih ditunjukkan dalam warna merah). Untuk meningkatkan kecekapan, kawasan bertindih antara serpihan boleh ditingkatkan dan nilai Tmnya dijamin konsisten. Reka bentuknya adalah seperti berikut:

 

 

Kapal dengan ais basah; disimpan pada -20 darjah , sah selama 12 bulan.

 

 

Komponen	G3351-20T	G3351-100T
2×In-Fusion Cloning Mix Plus	100 μL	5 x 100 μL
pUC19 (Linearized, Control Vector, 5 ng/μL)	10 μL	10 μL
Inset Kawalan (10 ng/μL)	10 μL	10 μL
Manual	Satu salinan

 

 

Lakukan tindak balas ligation

1. Pada tiub mikrosentrifuge 1.5-ml yang diautoklaf, tambahkan yang berikut(syorkan 10-sistem tindak balas uL):

Komponen	Kelantangan
2×In-Fusion Cloning Mix Plus	5 μL
DNA vektor	X μL
Masukkan DNA	Y μL
Air Tanpa Nuklease	Tambah kepada 10 μL

 

2. Gaul perlahan-lahan dan sentrifuge sebentar untuk membawa kandungan ke bahagian bawah tiub.

3. Untuk tindak balas penggabungan semula serpihan tunggal, eramkan pada suhu 50 darjah selama 15 minit; Untuk penggabungan semula berbilang serpihan, eramkan pada 50 darjah selama 30 minit.

 

NOTA:Untuk 3-5 penggabungan semula berbilang serpihan, meningkatkan masa tindak balas akan menghasilkan lebih banyak koloni, tetapi tidak boleh melebihi 1 jam).

4. Letakkan tiub di atas ais dan Teruskan segera ke "Lakukan tindak balas transformasi".

 

 

5. Tambahkan tindak balas ligation yang sesuai ke dalam E. coli Cekap Secara Kimia (seperti DH5, Top10, dll.) dan gaul perlahan-lahan. Jangan bancuh dengan paip atas dan bawah.

6. Inkubasi selama 30 minit di atas ais.

7. Kejutkan haba sel selama 30 saat dalam mandi air 42 darjah.

8. Segera letakkan tiub di atas ais dan eramkan selama 2 minit.

9. Tambah 900 µL suhu bilik SOC atau medium LB. Tutup tiub dengan ketat dan goncangkan tiub secara mendatar pada 225 rpm selama 1 jam pada 37 darjah .

10. Sebarkan isipadu tindak balas transformasi yang diperlukan pada plat LB yang telah dipanaskan terlebih dahulu yang mengandungi antibiotik yang sepadan.

11. Eramkan pinggan semalaman pada suhu 37 darjah .

 

 

Pilih koloni individu daripada plat transformasi, analisa transforman dengan PCR koloni atau penghadaman enzim sekatan.

 

 

1. DNA vektor dan DNA sisipan hendaklah ditulenkan dengan gel dan menganalisis kualiti dan kepekatannya dengan elektroforesis. Air boleh diketepikan dalam tindak balas pengikatan jika kepekatannya rendah.

2. The Tm value between the overlapping regions of multiple fragments should be consistent and >60 darjah.

3. Adalah disyorkan bahawa nisbah molar vektor dan sisipan ialah 1:1~1:3; apabila 2-3 serpihan disambungkan, nisbah molar antara setiap serpihan ialah 1:1, dan sistem tindak balas pengikatan boleh ditingkatkan dalam perkadaran yang sama.

4. Jika jumlah isipadu vektor dan sisipan lebih daripada 5 μL, anda boleh menskalakan sistem pengikatan kepada 20 μL.

5. Jumlah produk pengikatan tidak boleh melebihi 1/10 daripada jumlah sel yang kompeten, jika tidak kecekapan transformasi akan berkurangan dengan ketara. Isipadu produk pengikatan dan sel kompeten boleh ditingkatkan dalam perkadaran yang sama (contohnya, 20 μL sistem pengikatan mengubah 200 μL sel kompeten).

6. 2×Universal Ligation Mix shoule disimpan pada -20 darjah sehingga dalam 5-10 minit penggunaan dan dikembalikan serta-merta ke -20 darjah selepas digunakan. Adalah disyorkan untuk membekukan dalam aliquot untuk mengurangkan kitaran beku-cair.

7. Jika elektroporasi digunakan untuk penjelmaan, DNA vektor dan DNA sisipan hendaklah ditulenkan dengan kaedah lajur atau kaedah pemendakan etanol.

 

 

1. Plasmid rekombinan membina gambar rajah proses eksperimen

 

A. Sisipkan serpihan DNA diperoleh melalui amplifikasi PCR:Jujukan homolog 15-25 bp (hijau dan biru muda) daripada hujung vektor linear dimasukkan ke dalam 'hujung primer hadapan/balikan serpihan sasaran, dan Urutan akhir 5' dan 3' produk yang dikuatkan adalah benar-benar konsisten dengan dua jujukan akhir vektor linear, masing-masing.

B. Penyelarasan vektor plasmid: Endonuklease sekatan atau PCR terbalik telah digunakan untuk mendapatkan vektor linear.

C. In-Fusion Cloning Plus: Pembawa linear dan serpihan sisipan yang telah dimurnikan dan dipulihkan dicampur dalam perkadaran, dan tindak balas diselesaikan pada 50 darjah selama 15 minit.

D. Sel-sel yang diubah: Produk tindak balas terus ke dalam sel escherichia coli yang kompeten, pertumbuhan koloni monoklonal mengambilnya daripada tablet untuk PCR, pencernaan enzim dan penjujukan eksperimen saringan klon positif.

 

2. Mutasi titik tunggal plasmid rekombinan membina gambar rajah proses eksperimen

A. PCR dua serpihan(PCR menguatkan serpihan DNA pada kedua-dua hujung tapak mutasi): Primer pelengkap direka di tapak mutasi (oren), dan primer direka pada kedua-dua hujung gen mutan untuk memperkenalkan jujukan homolog pada penghujungnya. daripada 15-25 bp vektor linear (hijau dan biru muda). Menggunakan primer yang berbeza untuk penguatan PCR, masing-masing, mutasi dalam dua keping dengan urutan homolog dua serpihan sisipan (termasuk) mutasi gen masing-masing.

B. Penyelarasan vektor plasmid: Endonuklease sekatan atau PCR terbalik telah digunakan untuk mendapatkan vektor linear.

C. In-Fusion Cloning Plus: Pembawa linear dan serpihan sisipan yang telah dimurnikan dan dipulihkan dicampur dalam perkadaran, dan tindak balas diselesaikan pada 50 darjah selama 15 minit.

D. Sel-sel yang diubah: Produk tindak balas terus ke dalam sel escherichia coli yang kompeten, pertumbuhan koloni monoklonal mengambilnya daripada tablet untuk PCR, pencernaan enzim dan penjujukan eksperimen saringan klon positif.

 

3. Gambarajah skematik proses eksperimen pembinaan plasmid rekombinan pemasukan berbilang serpihan

A. Penguatan PCR bagi serpihan tambahan: Urutan homolog (ditandai hijau, biru tua, kuning dan biru muda) telah ditambahkan pada hujung 5' primer penguatan, supaya terdapat 15-25 urutan homolog bp antara hasil penguatan dan antara hasil penguatan dan vektor linear. Pasangan primer yang berbeza digunakan untuk menguatkan serpihan DNA (bertanda oren, merah dan ungu).

B. Penyelarasan vektor plasmid: Endonuklease sekatan atau PCR terbalik telah digunakan untuk mendapatkan vektor linear.

C. In-Fusion Cloning Plus: Pembawa linear dan serpihan sisipan yang telah dimurnikan dan dipulihkan dicampur dalam perkadaran, dan tindak balas diselesaikan pada 50 darjah selama 15 minit.

D. Sel-sel yang diubah: Produk tindak balas terus ke dalam sel escherichia coli yang kompeten, pertumbuhan koloni monoklonal mengambilnya daripada tablet untuk PCR, pencernaan enzim dan penjujukan eksperimen saringan klon positif.

 

Untuk Kegunaan Kajian Sahaja!

 

 

Cool tags: Campuran pengklonan 2×in-fusion campur, China 2×in-fusion campuran pengklonan campur pengilang, pembekal, kilang