Kit Maxiprep Plasmid

Dengan menggunakan kaedah lisis alkali klasik dan pengikatan boleh balik membran gel silika kepada asid nukleik, kit boleh mengekstrak 500 ug~1500 ug DNA plasmid daripada Escherichia coli yang dikultur semalaman dengan 100 mL. Plasmid yang diekstrak boleh digunakan secara langsung dalam pelbagai eksperimen biologi molekul, seperti reaksi penghadaman enzim sekatan, tindak balas ligation, amplifikasi PCR, penjujukan, transformasi, dll.

RNase A dihantar dengan ais basah dan disimpan pada -20 darjah . Reagen lain dihantar dan disimpan pada suhu bilik; sah selama 12 bulan.

1. Etanol kontang dan 50 mL tiub emparan bebas nuklease diperlukan tetapi tidak dibekalkan dalam kit ini.

2. Tambahkan semua RNase A yang disediakan dalam kit ke Buffer P1 sebelum digunakan, dan ia boleh disimpan pada 2~8 darjah selama 6 bulan.

3. Sila tambahkan 75 mL etanol kontang ke Penampan PD dan 163 mL etanol kontang ke Penampan PW sebelum digunakan.

4. Jika Penampan P2 mendakan, sila panaskan dalam tab mandi air pada suhu 37 darjah selama beberapa minit untuk memulihkan penjelasan. Selepas menggunakan Penampan P2, penutup hendaklah ditutup serta-merta untuk mengelakkan sentuhan jangka panjang dengan udara.

5. Sila pra-sejukkan Penampan P3 pada 4 darjah atau mandi ais sebelum digunakan.

1. Baki lajur: Tambah 2.5 mL Penampan BL kepada Lajur DNA HiBind, sentrifuge pada 10,000×g selama 2 minit, buang turasan dan masukkan semula Lajur DNA HiBind ke dalam Tiub Pengumpulan (lajur yang dirawat adalah paling baik digunakan pada hari yang sama).

2. Tuai kultur bakteria daripada 100 mL cecair bakteria segar dengan sentrifugasi pada 10,000×g selama 1 minit pada suhu bilik. Kumpulkan kultur dalam tiub emparan 50 mL (keluarkan supernatan sebanyak mungkin). Plasmid dengan salinan rendah atau lebih daripada 10 kb mencadangkan pengumpulan bakteria yang dikultur semalaman dengan 200mL, dan dos Penampan P1, Penampan P2 dan Penampan P3 harus ditingkatkan dalam perkadaran yang sama.

3. Tambah 8 mL Penampan P1 (sila semak sama ada hendak menambah RNase A terlebih dahulu), gunakan pipet atau pengayun vorteks untuk menangguhkan bakteria dengan teliti (pastikan untuk menyebarkan bakteria dengan teliti, jika tidak, ia akan menjejaskan lisis, mengakibatkan dalam kualiti rendah dan ketulenan plasmid yang diekstrak).

4. Tambah 8 mL Penampan P2, serta-merta dan perlahan-lahan terbalikkannya selama 8~10 kali untuk menjadikan bakteria itu lisis sepenuhnya (langkah ini tidak boleh digoncang dengan kuat, dan perlu dilakukan dalam masa 5 minit). Pada ketika ini, larutan harus menjadi jernih dan melekit, jika ia tidak menjadi jernih, mungkin terdapat terlalu banyak bakteria dan lisis tidak lengkap, ia boleh diterbalikkan perlahan-lahan 5 ~ 8 kali lagi sehingga penyelesaiannya sepenuhnya jelas.

5. Tambah 8 mL Penampan P3 (pra-sejukkan pada 4 darjah lebih awal), dengan serta-merta dan perlahan-lahan terbalikkan 10~12 kali, larutan kelihatan terkumpul padat, sentrifuge pada 10,000×g selama 10~15 min pada suhu bilik, perlahan-lahan tuangkan supernatan ke dalam Penapis Lajur, tolak pemegang untuk menapis, dan turasan dikumpulkan dalam 50 mL Bebas Nuklease tiub empar (disediakan sendiri).

6. Tambah etanol kontang 0.5 kali ganda isipadu larutan di atas, campurkan terbalik dan pindahkan ke Lajur DNA HiBind (tidak lebih daripada 10 mL setiap kali).

7. Empar pada 10,000×g selama 2 minit pada suhu bilik, buang turasan. Letakkan semula Lajur DNA HiBind ke dalam Tiub Pengumpulan (penyelesaian dalam langkah 6 boleh melalui lajur berkali-kali).

8. Tambah 10 mL Penampan PD (sahkan sama ada untuk menambah etanol kontang) pada Lajur DNA HiBind, sentrifuge pada 10,000×g selama 2 minit pada suhu bilik, buang turasan. Letakkan semula Lajur DNA HiBind ke dalam Tiub Pengumpulan.

9. Tambah 10 mL Penampan PW (sahkan sama ada menambah etanol kontang) ke Lajur DNA HiBind, sentrifuge pada 10,000×g selama 2 minit pada suhu bilik, buang turasan. Letakkan semula Lajur DNA HiBind ke dalam Tiub Pengumpulan.

10. Ulang langkah 9.

11. Empar pada 10,000×g selama 5 minit pada suhu bilik, letakkan Lajur DNA HiBind dalam Tiub Centrifuge 50 mL Bebas Nuklease baharu. Buka penutup dan letakkan 10 minit pada suhu bilik untuk meruapkan etanol dengan teliti.

12. Tambah 1~1.5 mL Penampan TE atau Air Tanpa Nuklease ke tengah membran dan letakkan pada suhu bilik selama 5 min. Empar pada 10,000×g selama 5 min. Jika anda perlu meningkatkan kecekapan pemulihan plasmid, penyelesaian yang diperoleh boleh ditambahkan semula pada Lajur DNA HiBind, letakkan pada suhu bilik selama 5 minit dan sentrifuge pada 10,000×g selama 5 minit.

13. DNA plasmid yang diperolehi boleh dipelihara untuk masa yang lama pada -20 darjah .

1. Sila baca Manual Produk dengan teliti sebelum digunakan.

2. Jika bilangan salinan plasmid adalah rendah atau DNA plasmid lebih besar daripada 10kb, adalah disyorkan untuk mengumpul kultur semalaman sebanyak 200 mL, dan dos Penampan P1, Penampan P2 dan Penampan P3 hendaklah ditingkatkan dalam perkadaran yang sama.

3. Penampan TE boleh dipanaskan pada 60~65 darjah dan masa pengeraman elusi boleh dipanjangkan untuk meningkatkan kecekapan elusi.

4. Etanol hendaklah dicairkan sepenuhnya sebelum mengelusi plasmid untuk mengelakkan pengaruh sisa etanol pada eksperimen hiliran.

5. Untuk keselamatan dan kesihatan anda, sila pakai kot makmal dan sarung tangan pakai buang.

Untuk Kegunaan Kajian Sahaja!

Cool tags: plasmid maxiprep kit, China plasmid maxiprep kit pengeluar, pembekal, kilang