Kesimpulan Pertama:
Semua empat teknik-PCR, qPCR, RT-PCR, dan RT-qPCR-berdasarkan tindak balas rantai polimerase (PCR), terutamanya berbeza dalam bidang aplikasi dan sasaran pengesanan mereka.
- PCR terutamanya digunakan untuk penguatan dan pengesanan urutan DNA.
- QPCR membolehkan pengesanan kuantitatif masa nyata kandungan DNA atau cDNA.
- RT-PCR terutamanya digunakan untuk penguatan dan pengesanan molekul RNA.
- RT-qPCR menggabungkan teknik RT-PCR dan qPCR untuk menganalisis molekul RNA secara kuantitatif.
▆ I. Standard PCR
PCR standard, juga dikenali sebagai PCR generasi pertama, menggunakan DNA dua stranded sebagai templat dan DNTP sebagai substrat untuk menguatkan DNA dua stranded secara khusus. Elektroforesis gel agarose kemudian digunakan untuk analisis kualitatif produk.
Proses PCR boleh dibahagikan kepada tiga langkah asas: denaturasi suhu tinggi (sekitar 95 darjah), penyepuh suhu rendah (antara 55 dan 60 darjah), dan sambungan suhu sederhana (sekitar 72 darjah, suhu tindak balas optimum untuk polimerase DNA).
Selepas beberapa kitaran denaturasi, penyepuhlindapan, dan lanjutan, gen sasaran dapat dikuatkan berjuta -juta kali. Elektroforesis gel boleh digunakan untuk mengesan DNA yang diperkuatkan (memisahkan DNA berdasarkan berat molekulnya untuk pengenalan dan pembersihan).
▆ Ii. PCR masa nyata kuantitatif (qPCR)
PCR masa nyata kuantitatif, PCR generasi kedua, mengumpul isyarat pendarfluor masa nyata dari gen sasaran berlabel siasatan pendarfluor semasa fasa lanjutan proses penguatan PCR. Nombor salinan atau tahap ekspresi gen sasaran ditentukan melalui hubungan antara tiga parameter: isyarat pendarfluor, nilai CT, dan kepekatan awal gen sasaran. Walau bagaimanapun, kerana hasil analisis kuantitatif mutlak bergantung kepada nilai CT dan lengkung standard, apa yang dipanggil "kuantifikasi" adalah relatif dalam erti kata. Selain itu, sensitiviti, ketepatan, dan resolusi pengesanannya terhad di bawah keadaan perbezaan halus dalam kepekatan template gen sasaran rendah salinan. Kedua -dua kaedah pendarfluor yang biasa digunakan dalam qPCR adalah probe Taqman dan SYBR Green.
▆ Iii. PCR transkripsi terbalik (RT-PCR)
PCR transkripsi terbalik (RT-PCR) melibatkan pembalikan menyalin helai RNA ke DNA pelengkap (menggunakan polimerase DNA yang bergantung kepada RNA, atau transkripase terbalik), yang kemudiannya digunakan sebagai templat untuk penguatan DNA melalui PCR (menggunakan primer deoxynucleotide dan DNA DNA polimerase). Setiap kitaran kemudian menggandakan jumlahnya, berikutan protokol PCR standard. RNA templat boleh menjadi jumlah RNA, mRNA, atau produk RNA yang ditranskripsikan in vitro.
▆ Iv. PCR transkripsi terbalik masa nyata (RT-qPCR)
Transkripsi terbalik masa nyata PCR (RT-qPCR) menggabungkan teknik RT-PCR dan qPCR untuk menganalisis molekul RNA secara kuantitatif. RT-qPCR digunakan secara meluas dalam kajian tahap ekspresi RNA, seperti analisis ekspresi gen dan pengesanan beban virus.
