Kit Ujian Pembiakan Sel Click-iT-555 EdU

 

nama produk	Pengenalpastian produk	model
Kit Ujian Pembiakan Sel Click-iT-555 EdU	G1602	100T

 

 

Menganalisis keupayaan percambahan sel adalah kaedah penilaian yang biasa dan penting dalam sains hayat. Ia boleh menilai pengaruh gen tertentu, ubat, dan lain-lain pada sel yang dikultur secara in vitro, atau menganalisis pertumbuhan dan keupayaan pembaharuan sel tisu di bawah keadaan atau rangsangan yang berbeza. Pada masa ini, terdapat banyak kaedah untuk mengesan percambahan sel. Kebanyakan mereka menggunakan beberapa enzim metabolik yang dihasilkan oleh sel untuk menilai secara tidak langsung aktiviti percambahan sel (seperti kaedah CCK-8, kaedah MTT, dll.), tetapi sesetengah ubat atau keadaan sel itu sendiri akan memberi kesan tertentu pada hasil penilaian. Pengesanan terus sintesis DNA dalam sel untuk menentukan percambahan sel diiktiraf sebagai kaedah pengesanan yang paling tepat dan berkesan. Walau bagaimanapun, kedua-dua kaedah pemerbadanan nukleosida berlabel radio asal dan penambahbaikan seterusnya kaedah BrdU berdasarkan pengesanan antibodi mempunyai batasannya sendiri.

EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine) ialah analog timidin yang mengandungi kumpulan asetilena, apabila disuntik ke dalam haiwan atau sel pengeram yang dikultur dalam vitro, molekul kecil ini boleh meresap dengan cepat ke pelbagai organ dan tisu, dan menyusup ke dalam sel, dan boleh menggantikan timidin (T) ke dalam DNA yang baru disintesis semasa percambahan sel. Kumpulan asetilena dalam molekul EdU boleh bertindak balas dengan probe sebatian azida berlabel iF488 yang berpendarfluor untuk membentuk cincin triazol yang stabil di bawah pemangkinan ion kuprum, jadi DNA yang baru disintesis boleh dilabelkan dengan probe pendarfluor yang sepadan. Berbanding dengan kaedah penggabungan nukleosida berlabel radio, kaedah pengesanan EdU tidak mempunyai faktor pengehad seperti pencemaran radioaktif; berbanding dengan kaedah pengesanan BrdU, kaedah pengesanan EdU tidak memerlukan denaturasi DNA atau tindak balas antigen-antibodi, yang sangat mengurangkan kerumitan eksperimen dan juga menjadikan eksperimen lebih menjimatkan masa, lebih sensitif, lebih stabil dan lebih tepat.

Kit ini boleh digunakan untuk mengesan pembiakan sel dalam sel kultur atau tisu haiwan. Siasatan pendarfluor dalam kit ini ialah pendarfluor merah, panjang gelombang pengujaan maksimum ialah 557 nm, dan panjang gelombang pancaran maksimum ialah 570 nm. Selepas sel yang membiak dilabelkan, nukleus sel akan menunjukkan pendarfluor merah terang, dan nukleus sel akan dilabelkan bersama dengan pewarna nuklear konvensional yang sepadan (Kit ini menyediakan pewarna nuklear sel Hoechst 33342), anda boleh menggunakan mikroskop pendarfluor, mikroskop confocal laser dan instrumen lain untuk memerhatikan secara langsung percambahan sel; anda juga boleh menggunakan sitometri aliran untuk mengesan keamatan pendarfluor sel kultur secara in vitro, dan kemudian menentukan kitaran sel berdasarkan aktiviti replikasi DNA intensiti pendarfluor dalam fasa pertengahan S.

 

 

Pengangkutan dengan ais basah; Reagen pemangkin EdU (Reagen A) dan penimbal tindak balas boleh disimpan pada 4 darjah, Sah selama 12 bulan.

 

 

Nombor Komponen	Komponen	G1602-100T
G1602-1	Penyelesaian storan EdU (10 mM)	100 μL
G1602-2	Reagen pemangkin (Reagen A)	120 μL
G1602-3	Pewarna pendarfluor iF555 (reagen B)	50 μL
G1602-4	Bahan tambah pemangkin (Reagen C)	2×100 mg(serbuk)
G1602-5	Penampan tindak balas	20 mL
G1602-6	larutan pewarna Hoechst 33342	30 μL
Manual		Satu salinan

 

 

1. Medium kultur sel yang mengandungi serum;

2. Reagen permeabilisasi:0.2%- 0.5% Triton® X-100 dalam PBS (G1204);

3. Fixative: 4% paraformaldehyde (G1101) atau reagen lain yang serupa;

4. Masin penimbal fosfat (PBS);

5. Air ultratulen;

6. Pemodelan haiwan dan reagen berkaitan bahagian tisu (pengesanan percambahan sel tisu haiwan)

 

 

1. Prarawatan sel kultur secara in vitro:

1.1. Tanam sel secara sama rata dalam plat kultur sel pada ketumpatan tertentu (ketumpatan penanaman ditentukan oleh faktor seperti saiz sel, kelajuan pertumbuhan, dll.). Selepas sel melekat pada dinding atau kembali ke keadaan normal, lakukan rangsangan ubat yang sepadan dan rawatan lain. (Untuk sel ampaian, sila ikut kaedah operasi biasa bagi sel ampaian. Keseluruhan percubaan perlu menambah sentrifugasi dan langkah lain).

1.2. Bahan tambah pemangkin (Reagen C) telah disentrifugasi pada kelajuan rendah, 100 mg diambil dan dilarutkan dengan menambah 1 mL air ultratulen dan disalurkan dan disimpan pada darjah -20, serbuk yang tinggal disimpan sebagai rizab.

2. Pelabelan, penetapan dan permeabilisasi EdU selular in vitro:

2.1. Sediakan penyelesaian kerja pengeraman 2×EdU: tambahkan 2 μL larutan storan EdU (10 mM) kepada setiap 1 mL medium kultur sel lengkap, iaitu 20 μM 2×EdU larutan kerja pengeraman, dan masukkan ke dalam inkubator untuk dipanaskan terlebih dahulu ( saranan Kepekatan kerja EdU ialah 10 μM untuk eksperimen awal);

2.2. Dalam mod separuh berubah, aspirasikan separuh daripada medium kultur sel asal dalam plat kultur, dan tambahkan jumlah yang sama larutan kerja inkubasi 2×EdU yang dipanaskan terlebih dahulu, dan eramkan untuk tempoh masa tertentu (tempoh pengeraman biasanya bergantung pada kitaran pertumbuhan sel yang sepadan, yang biasanya menyumbang kira-kira 10% daripada kitaran sel Bagi kebanyakan sel yang melekat dan berkembang pesat, pengeraman selama kira-kira 2 jam adalah disyorkan. Untuk kes tertentu, ia perlu diselaraskan dengan ciri-ciri sel, keadaan sebenar selepas rawatan, dan lain-lain. Jika masa inkubasi yang lebih lama diperlukan, kepekatan kerja EdU boleh dikurangkan dengan sewajarnya untuk masa yang lebih singkat, kepekatan EdU boleh dikurangkan dengan sewajarnya; meningkat);

2.3. Selepas pengeraman EdU, basuh dengan penimbal PBS selama 1-2 kali, tambah cecair penetap untuk menutup sel dan tetapkan pada suhu bilik selama 15 minit (jika sitometri aliran diperlukan, sel yang melekat hendaklah dicerna dan digantung semula sebelum langkah ini betulkan, ikut kaedah pemprosesan sel penggantungan); Basuh 2-3 kali dengan penimbal PBS, 3-5 min setiap kali;

2.4. Keluarkan penimbal PBS, tambah larutan permeabilisasi untuk menutup sel, dan eramkan pada suhu bilik selama 15 minit;

2.5. Keluarkan penyelesaian permeabilisasi, basuh 1-2 kali dengan penimbal PBS, 3-5 min setiap kali. Kemudian pergi ke langkah 4.

3. Pemodelan suntikan EdU haiwan serta pemprosesan bahagian tisu:

3.1. Mengikut keperluan percubaan, satu atau lebih suntikan EdU digunakan untuk memodelkan haiwan melalui suntikan intraperitoneal, suntikan intramuskular, suntikan subkutaneus, suntikan urat ekor, dsb. Secara amnya, nisbah dos EdU kepada berat badan haiwan ialah 5 mg/kg, jumlah sebenar dos suntikan bergantung kepada kandungan penyelidikan dan keadaan haiwan. Penyelesaian storan EdU yang disediakan dalam kit ini digunakan terutamanya untuk pelabelan EdU sel in vitro. Jika anda perlu memodelkan haiwan dengan EdU, anda boleh memesan reagen EdU secara berasingan (No. Cat.: G5059);

3.2. Sel-sel epitelium seperti usus kecil membiak dengan cepat, manakala sel-sel otak membiak dengan perlahan. Tisu yang tumbuh lebih cepat biasanya mengambil masa kurang daripada 12 jam untuk pelabelan, manakala tisu yang tumbuh lebih perlahan mungkin mengambil masa beberapa hari untuk pelabelan. Masa pelabelan optimum ditentukan mengikut eksperimen tertentu. Disebabkan oleh percambahan pesat tisu epitelium usus, tisu tersebut disyorkan sebagai rujukan untuk pelabelan.

3.3. Selepas haiwan itu dibunuh mengikut piawaian yang ditetapkan, tisu yang diperlukan dikeluarkan dan bahagian beku atau bahagian parafin dibuat mengikut prosedur konvensional:

a. Untuk bahagian beku: kembalikan bahagian ke suhu bilik, tambah jumlah cecair Pembetul yang sesuai dan tetapkan pada suhu bilik selama 15 minit. Keluarkan cecair Fixing dan basuh 3 kali dengan penimbal PBS selama 3-5 min setiap satu; keluarkan penimbal PBS dan tutup tisu dengan jumlah penyelesaian permeabilisasi yang sesuai dan inkubasi pada suhu bilik selama 10-15 min; keluarkan penyelesaian permeabilisasi dan basuh dengan penimbal PBS 1- 2 kali, 3-5 min setiap kali. Kemudian pergi ke langkah 4.

b. Untuk bahagian parafin: Nyahparafin dan cairkan semula bahagian tersebut, dan basuh dengan PBS selama 5 minit. Keluarkan penimbal PBS, tambah larutan permeabilisasi untuk menutup sel atau tisu, dan eramkan pada suhu bilik selama 15 minit; Kemudian basuh dengan penimbal PBS selama 1-2 kali, setiap kali selama 3-5 min. Kemudian pergi ke langkah 4.

4. Reaksi klik EdU:

4.1. Semasa penetapan dan penembusan sel atau tisu, penyediaan larutan tindak balas: campurkan reagen mengikut nisbah berikut, isipadu penyediaan boleh ditambah atau dikurangkan mengikut kadar bilangan sampel.

 

Komponen	Kelantangan (untuk sel)	Isipadu (untuk bahagian Histologi)
penimbal tindak balas	935 μL	928 μL
Reagen A	10 μL	10 μL
Reagen B (pewarna iF555)	5 μL	12 μL
Reagen C	50 μL	50 μL
jumlah kapasiti	1000 μL	1000 μL

 

4.2. Keluarkan penimbal PBS daripada sel atau bahagian, tambah larutan tindak balas, goncang perlahan-lahan untuk memastikan penyelesaian tindak balas meliputi semua sel atau tisu, dan eramkan selama 30 minit pada suhu bilik dalam gelap;

4.3. Keluarkan larutan tindak balas, basuh 2-3 kali dengan penimbal PBS, 3-5 min setiap kali (Jika tiada keperluan khas lain, keamatan pendarfluor boleh dikesan oleh sitometri aliran atau kesan pendarfluor boleh dikesan dengan instrumen lain).

5. Noda nuklear (pilihan):

5.1. Cairkan larutan pewarnaan Hoechst 33342 dengan penimbal PBS pada nisbah 1:500-1000, tambah pada sampel untuk menutup sel dan eramkan selama 5 minit;

5.2. Keluarkan larutan pewarna Hoechst 33342, basuh 2-3 kali dengan penimbal PBS, 3-5 min setiap kali.

6. Analisis pengimejan dan pengesanan:

Gunakan mikroskop pendarfluor atau mikroskop confocal untuk mengesan sel yang diproses atau sampel bahagian tisu, dan menganalisis bahagian sel yang membiak. Sebagai alternatif, sel yang dikultur secara in vitro boleh dikumpul dan keamatan pendarfluor boleh diukur dengan sitometri aliran (adalah disyorkan untuk menggunakan sampel sel yang tidak dilabelkan dengan EdU sebagai kawalan negatif untuk ujian sitometri aliran dan untuk memilih voltan yang sesuai), dan berdasarkan pada keamatan pendarfluor, aktiviti replikasi DNA fasa-S dalam kitaran sel boleh ditentukan. Pewarna pendarfluor if555 (Reagen B) dalam kit ini sepadan dengan pencirian spektrum Ex/Em: 557 nm/570 nm (merah); Larutan pewarnaan Hoechst 33342 sepadan dengan pencirian spektrum Ex/Em: 346 nm/460 nm (biru).

 

 

1. Untuk sel kultur, kepekatan EdU khusus dan masa pengeraman boleh dilaraskan dengan sewajarnya bergantung pada sampel dan tujuan penyelidikan.

2. Sesetengah sel tisu membiak dengan perlahan. Untuk mengelakkan kesan pemodelan yang lemah, disyorkan untuk memilih sampel tisu dengan pembiakan pantas sebagai sampel rujukan (seperti tisu usus).

3. Jika warna latar belakang terlalu gelap, ia mungkin disebabkan oleh pencucian yang tidak mencukupi, masa yang lama ditetapkan, dan sisa fiksatif, dsb. dalam eksperimen.

4. Reagen C (EdU catalytic addition reagent) mudah teroksida. Cuba elakkan pendedahan berpanjangan kepada udara. Selepas disediakan sebagai larutan akueus, disyorkan untuk disimpan dalam aliquot; Diuji, seperti warna reagen aditif pemangkin EdU berubah sedikit, sistem pemangkin tindak balas klik masih dapat meneruskan secara normal. jika reagen C kelihatan coklat, ia menunjukkan bahawa komponen telah tamat tempoh, jadi sila buangnya.

5. Untuk kesihatan dan keselamatan anda, sila pakai kot makmal dan sarung tangan semasa operasi.

 

Untuk Kegunaan Kajian Sahaja!

 

 

Cool tags: click-it edu-555 kit ujian proliferasi sel, China click-it edu-555 kit ujian proliferasi sel pengilang, pembekal, kilang